磷酸化蛋白WB检测步骤及注意事项
发布时间：
2023-04-27 16:57
一、操作步骤
- 蛋白提取（贴壁细胞）：将细胞培养板从CO2培养箱中取出弃去培养基，用PBS清洗一遍。将培养板放置在冰上，吸取事先配制好的western 及IP细胞裂解液、PMSF、磷酸酶抑制剂（western 及IP细胞裂解液、PMSF、磷酸酶抑制剂体积比为 1000∶10∶10）加入到培养板中，每孔200µl。加入后立马用细胞刮板将细胞刮下，待细胞全部刮下后收集到1.5ml EP管中，置冰上用细胞破碎仪进行破碎2min。破碎完成后进行离心（12000 rpm、4℃、3min），最后收集上清进行变性，-20℃备用。
- 蛋白定量（浓度测定）：用BCA法检测蛋白浓度根据BCA蛋白试剂盒说明说进行操作，然后在酶标仪上测其吸光度。根据吸光度值制作标准曲线，算出蛋白浓度以及上样体积。
- 配胶：根据目的蛋白分子量大小选择合适的分离胶。
- 电泳：浓缩胶（80V 30min）、分离胶（120V 90min）。
- 转膜：胶、膜、滤纸、顺序是：三层滤纸、胶、膜、三层滤纸，电流：252mA 时间：90min。
- 封闭：用4%BSA封闭60min。
- 孵育抗体：一抗孵育过夜、然后用TBST清洗三次每次5分钟，二抗孵育60min。
- 显影：配制显影液然后将所有切割的膜放入显影液中，待膜完全浸湿后取出放入显影仪中拼凑起来，最后显影。
二、注意事项
- 蛋白提取全程在冰上进行。
在提取蛋白过程中很多实验人员在提取前半段通常没有在冰上操作，这是导致蛋白变性或降解的重要原因之一，温度过高会导致蛋白质变性，因此在提取过程中都应在冰上进行。
- 磷酸酶抑制剂严格按照说明书操作。
不同公司磷酸酶抑制剂的用量有差异，加入量太少则导致蛋白去磷酸化，从而提取不到磷酸化蛋白。
- 封闭液用4%BSA。
对于非磷酸化蛋白常用5%脱脂奶粉进行封闭，而磷酸化蛋白则不能，因奶粉中含有酪蛋白（磷酸化蛋白）能与抗体非特异性结合使条带背景变脏。
- 二抗孵育时间为1小时。
封闭时间过长会掩盖表面抗原阻止抗体结合。
- 孵育抗体结束后每次清洗时间为5min。
清洗时间过长导致信号减弱（抗体被洗脱）。
- 曝光时间不宜太长或太短。
磷酸化蛋白检测时背景往往比较深，所以曝光或压片时间要适当,不能太长或过短，太长则背景太深盖住了目的条带,时间过短则可能没有条带或者条带太浅。
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